NBT | 北大李毓龙组开发新型乙酰胆碱荧光探针——专家点评

责编 | 迦 溆

点评 | 胡 霁（上海科技大学）

乙酰胆碱是第一个被鉴定的神经递质，它的研究建立了神经递质的概念，并为解析神经突触信息传递的机理奠定了基础。尽管乙酰胆碱在外周神经系统（尤其是神经肌肉接点）的释放及功能已有了较为明确清晰的阐释，但其在中枢神经系统中的动态分布和功能重要性仍存在较大争议。乙酰胆碱能神经元在皮层等区域具有广泛投射，因此传统研究认为，作为广谱神经调质，乙酰胆碱在多个脑区的作用是均一化的（如调节觉醒等生理功能）。然而，随着近年来神经环路研究的推动，研究者逐渐解析了乙酰胆碱能神经元参与的神经环路与学习记忆、注意、奖赏等行为的相关性，而且其功能多呈现区域特异性，甚至神经元特异性。与此相对应的是，多种复杂神经疾病如成瘾、阿兹海默症等都伴随着特定脑区胆碱能信息传递的异常。“工欲善其事，必先利其器”。要想进一步了解乙酰胆碱的生理功能，及其在疾病发生中的作用，必须打破“瓶颈”，对乙酰胆碱在特定生理行为中的动态变化进行实时、实地、高灵敏度的精确追踪。

7月9日，北京大学生命科学学院李毓龙研究组在Nature Biotechnology杂志在线发表了题为A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies的研究论文，首次成功开发了具有高灵敏度、高特异性且可遗传编码的乙酰胆碱荧光探针，并成功实现了在不同生物体系中对于内源乙酰胆碱信号的释放及调控的实时检测，为深入理解神经递质乙酰胆碱在生物体中的生理功能及其在疾病发生过程中的可能贡献提供了重要的工具。

与其一切从头设计，不如借鉴大自然的鬼斧神工。李毓龙组首次通过对神经递质特异性的G蛋白偶联受体（GPCR）进行改造，通过在GPCR特定位点嵌入循环重排的荧光蛋白，将受体在被神经递质激活后的构象变化转变为荧光蛋白荧光信号强弱的变化，进而精确而快速地报告特定神经递质的浓度变化。通过对乙酰胆碱受体的改造以及一系列突变筛选和优化，李毓龙组发展出对乙酰胆碱具有高灵敏光学响应的荧光探针。此探针对生理浓度乙酰胆碱具有高信噪比的光学信号变化，并且具有亚秒级动力学及高度分子特异性，可实现对时空特异性乙酰胆碱信号的精确指征。

在接下来的工作中，李毓龙组应用新开发的乙酰胆碱探针，在小鼠的多个脑区的急性脑片体系中成功检测到内源乙酰胆碱的释放及其在生理情况下的空间作用范围，并阐明了突触前神经元活性调控乙酰胆碱释放的分子机理，为解决该领域长久以来的争论提供了直接的实验证据。同时，在活体果蝇的嗅觉系统中，李毓龙组成功地检测到内源乙酰胆碱在嗅觉信息编码中的时空特异性分布，并阐释其功能；在小鼠的视觉皮层神经元，他们还成功监测了乙酰胆碱在注意性视觉刺激时的动态变化。这一系列工作为深入理解乙酰胆碱在不同生理情况下的释放及其功能奠定了扎实的基础。

李毓龙组博士研究生井淼为文章的第一作者，合作者朱骏组的张鹏博士为共同一作。北京大学生命中心的李毓龙研究员与弗吉尼亚大学朱骏教授为文章的共同通讯作者。

专家点评

胡霁（上海科技大学生命科学与技术学院PI，青年千人）

Comments：（为了简化起见，本文所指神经递质为广义，包含神经递质，神经调质以及神经肽）

神经科学的一个重要挑战是建立特定神经环路的活动与行为之间的逻辑关系。为此，需要对特定类型神经元的活动进行检测。神经生理学的发展，已经建立了两个常用的检测神经细胞活动的重要指标：第一个是细胞的膜电位，第二个是细胞内的钙离子浓度。这两个指标目前都有方法进行高时空分辨率的实时检测。但是神经活动还有一个关键的事件是神经递质通过突触传递在神经元之间进行信息交流。在突触及突触外空间中，兴奋性，抑制性和调节性神经递质的浓度和分布对于整个神经环路的活动状态至关重要。对于神经递质的浓度，传统上可以使用物理化学方法（FSCV，微透析等）进行检测。这些传统方法促进了我们对于神经递质在不同行为时的动态变化的了解。但是这些技术也存在很大局限，比如空间分辨率很低，不能实现细胞类型特异性等。近年来，随着基因工程和蛋白质工程技术的快速发展，基于基因编码的神经递质检测工具开始发展起来【1, 2】。李毓龙研究组正是基因编码的神经递质检测工具这个领域的领导者，即将发表多个重要的神经递质感受器。

这篇文章报道了一个高时空分辨率、高特异性、高灵敏度的基因编码的乙酰胆碱感受器。乙酰胆碱是非常重要的神经递质，除了直接控制神经肌肉接头之外，也对大脑功能非常重要，被认为可以调节许多重要行为，比如睡眠，注意力和决策以及感觉信息处理【3, 4】。胆碱能神经元的功能障碍也与神经系统疾病如阿尔茨海默病（AD）和精神分裂症有关【5, 6】。李毓龙组的研究策略是基于天然的乙酰胆碱的G蛋白偶联受体（M3）进行改造。他们在GPCR的第三个胞内段插入结构敏感的绿色荧光蛋白(cpGFP),当乙酰胆碱结合到这个改造的受体上时，蛋白质构象发生变化并牵扯cpEGFP构象变化，使得绿色荧光信号的上升。他们依据上膜效率，灵敏度（ΔF/F0），动态范围等指标进行大规模突变和筛选，最终得到了GACh2.0，它在细胞水平和在体水平（果蝇，小鼠）都表现了优良的性质。GACh2.0可以和遗传学操作（基因工程小鼠，病毒）相结合，从而有选择性的观测特定神经元的乙酰胆碱能输入。由于其优良的特性和方便的使用方式，相信GACh2.0将很快成为研究乙酰胆碱释放调控的细胞分子机理及其与特定行为之间的联系的重要工具。

参考文献

1. Marvin, J. S. et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamateneurotransmission. Nat Methods 10, 162-170, doi:10.1038/nmeth.2333(2013).

2. Patriarchi, T. et al. Ultrafast neuronal imaging ofdopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science 360, doi:10.1126/science.aat4422 (2018).

3. Ma, M. &Luo, M. Optogenetic activation of basal forebrain cholinergic neurons modulatesneuronal excitability and sensory responses in the main olfactory bulb. J Neurosci 32, 10105-10116, doi:10.1523/JNEUROSCI.0058-12.2012 (2012).

4. Xu, M. et al. Basal forebrain circuit forsleep-wake control. Nat Neurosci 18, 1641-1647, doi:10.1038/nn.4143(2015).

5. Deutsch, S. I.,Urbano, M. R., Neumann, S. A., Burket, J. A. & Katz, E. Cholinergicabnormalities in autism: is there a rationale for selective nicotinic agonistinterventions? Clin Neuropharmacol 33, 114-120,doi:10.1097/WNF.0b013e3181d6f7ad (2010).

6. Hampel, H. et al. The cholinergic system in thepathophysiology and treatment of Alzheimer's disease. Brain 141, 1917-1933,doi:10.1093/brain/awy132 (2018)

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